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导读:

人牙髓间充质干细胞(hDPSCs)是临床治疗中较好的细胞来源,具有高增殖能力、多向分化潜能、免疫调节能力等多种优点,hDPSCs一般在含有胎牛血清(FBS)的培养基中进行分离和扩增,但是出于安全性的考虑,迫切需要在符合标准生产规范(GMP)的环境下进行培养,所以选择一款不含血清的培养基并评价其性能将是至关重要的。


小编今天将带领大家对比一下符合GMP的无异种血清培养基(AMMS®MSC试剂盒套装2.0,AS-13)与含血清培养基(SCF)培养hDPSCs的效果差异。

人牙髓间充质干细胞(hDPSCs)来源于9颗正畸牙齿(杭州口腔医院正畸科),hDPSCs分别平行在两种培养基中进行分离与培养,主要通过实验:集落形成单位(CFU)试验、流式细胞仪免疫表型分析、三系分化分析、神经细胞定向分化试验、荧光倒置显微镜观察、实时聚合酶链反应、SA-β-gal分析等实验系统比较了这两种培养基的细胞特性,包括形态、增殖、标记表达、分化、干细胞、衰老和细胞因子分泌等各项指标。

01
分离与扩增

在两种培养基中传代培养的hDPSCs粘附在培养皿的底部,并显示出典型的纺锤形形态,但AMMS的细胞更细长,P1代SCM和AMMS培养的细胞PDT分别为28.11±4.50h和28.55±3.10h(p=0.625)。随着传代的进行,两种培养基中细胞的PDT逐渐增加,SCM中细胞的PDT增加更快。到P5时,SCM中细胞的PDT显著升高。侧面说明显示AMMS有更高的分离成功率。


02
CFU

CFU形成是细胞系增殖或自我更新能力的良好指标。在这项研究中,我们计算了P2和P5的hDPSCs形成的细胞集落数。分析表明,在SCM和AMMS培养的hDPSCs之间,以及在相同培养基中培养的P2和P5的hDPSCs之间,CFU形成率没有显著差异。在SCM中培养的细胞形成的集落更立体和聚集,而在AMMS中培养的细胞形成的集落扁平、松散和更大。这可能表明在AMMS培养的细胞具有更高的增殖能力。


03
内皮祖细胞的免疫表型

根据ISCT对骨髓间充质干细胞的定义,我们用流式细胞仪检测了P2和P5的hDPSCs的免疫表型,包括CD73、CD90、CD105、CD45、CD14、CD19、CD34、HLA-DR,>95%,几乎不表达CD45、CD14、CD19、CD34和HLA-DR<2%。统计分析显示,在SCM和AMMS中培养的细胞之间的表达百分比没有显著差异(所有p> 0.05),以及在相同培养基中培养的P2和P5的细胞之间没有差异。

SCM和AMMS培养的hDPSCs免疫表型标志物的表达,阴性对照(绿色),人类牙髓干细胞;


SCM:含血清培养基;  AMMS:无血清/异种培养基(新蒲京娱乐场官网8555cc)

04
干性和衰老分析

干性保持是评估细胞质量和细胞制造过程适用性的一个很好的特征。在这里通过实时PCR检测多潜能标记基因的表达NANOG、OCT4和SOX2。P2和P5的细胞在SCM和AMMS培养的细胞中,这三种基因的表达都没有表现出任何差异。然而培养至P5时,确实导致了SCM中SOX2的表达(p=0.002)。这些结果可能反映了当细胞在AMMS培养时,干细胞保持得稍好。通过基于SA-β-gal活性的染色来检测扩增期间的细胞衰老,检测表明衰老细胞的比例很低(SCM:9.92±2.54%;AMMS:10.03±2.81%)。


分析干细胞相关基因(NANOG,OCT4,SOX2)的表达和传代培养过程中的细胞衰老

(a) 在P2和P5的SCM和AMMS中培养的细胞之间的相对mRNA表达比较(在P2的SCM中培养的不同基因的表达作为对照);

(b) SA-β-GAL染色(蓝色细胞表示衰老);

(c) 当在SCM中培养时SA-β-gal阳性细胞与总细胞的比率与P5时AMMS的比较(p=0.97)(比例尺=200微米);


SCM:含血清培养基;  AMMS:无血清/异种培养基(新蒲京娱乐场官网8555cc)

05
细胞因子分泌

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测P5细胞分泌的细胞因子,包括HGF、FGF2、BDNF、GDNF、IL-6、IL-10、PGE2和TGFβ1。结果显示,与SCM培养的细胞相比,AMMS培养的细胞HGF的表达较高,而PGE2和TGFβ1的表达较低。这些数据表明,与SCM中分离的hDPSCs相比,在AMMS分离的hDPSCs表现出更高的增殖和自我更新能力。

06
体外三系分化潜能

许多研究证明了hDPSCs向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化能力.茜素红染色显示,在两种培养基中培养的hDPSCs在诱导后显示出大量的矿物质沉积,但是成骨标记物(ALP和RUNX)是在AMMS扩大的hDPSCs中检测到的。与先前的研究一致,在SCM中培养的hDPSCs显示出有限的成脂分化潜能,但在AMMS扩增的hDPSCs表现出更明显的脂滴染色和更高的标记基因(LPL和PPARγ)成脂诱导下的表达。总的来说,在AMMS扩增的hDPSCs比在SCM中扩增的显示出更高的成骨和成脂潜能。

P5时在SCM和AMMS中培养的hDPSCs的三系分化潜能

(a)分别用茜素红、油红O和阿利新蓝染色显示hDPSCs的成骨、成脂和成软骨能力;

(b)成骨相关基因(ALP,RUNX2)的相对mRNA表达水平;

(c)成脂相关基因(LPL,PPARγ)的相对mRNA表达水平;

(d)软骨形成相关基因(ACAN,SOX9)的相对mRNA表达水平(比例尺=200微米,*p<0.05);

人类牙髓干细胞;

SCM:含血清培养基;  AMMS:无血清/异种培养基(新蒲京娱乐场官网8555cc)



总结


所以综合来看,相比SCM,AMMS更有优势,并且在现行的管理体系下,无血清培养基替换含血清培养基是大势所趋,不仅提高了细胞培养的可重复性,避免了由于血清批次之间差异的影响,减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险、血清中某些因素对有些细胞的毒性、血清中蛋白对某些生物测定的干扰,更有利于对实验结果的分析等等。

新蒲京娱乐场官网AMMS® MSC试剂盒套装2.0,适用于原代及冻存间充质干细胞的培养扩增,成分明确,稳定性高,操作简单,无需添加谷氨酰胺,无血清,无异源成分,扩增效率高,表型稳定。产品已通过美国FDA的DMF备案(035589),干细胞药物临床实验最佳选择。

参考文献:

1. JUAN LIXUEWEI LVTINGTING GEC, JIAMAN SHI,GIDEON VERWOERD,HAIYAN LIN and  YUANSONG YU, Improved Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) Isolated and Expanded in a GMP Compliant and Xenogeneic Serum-free Medium.



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新蒲京娱乐场官网8555cc最新网站,专注细胞和基因治疗(CGT)上游GMP级原料试剂研发及生产,为CGT用户提供产品与服务的整体解决方案。产品涉及细胞分选磁珠试剂、真核/原核重组蛋白、无血清培养基、细胞培养试剂盒等。

公司建有3200的研发实验室及GMP级洁净车间,包括细胞分选磁珠开发平台、真核与原核蛋白表达工程平台、无血清培养基开发平台,通过ISO13485和ISO9001双质量体系认证,部分产品已获美国FDA DMF备案。

 

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